Caspase 9活性检测试剂盒
(比色法)
产品简介:
Caspase 9 活性检测试剂盒(Caspase 9 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中Caspase 9酶活性或纯化的Caspase 9酶活性的试剂盒。
Caspase 9 活性检测试剂盒是基于casepase 9可以催化Caspase-9底物产生黄色的pNA,pNA在405nm附近有强吸收,从而可以通过测定吸光度来检测caspase 9的活性。 Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。线粒体释放细胞色素c以后,caspase 9可以和细胞色素c以及Apaf1形成复合物,同时被激活。激活的caspase 9可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase 3,从而促进后续的细胞凋亡信号。
Caspase 9的激活可以通过磷酸化进行调控。 本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测,可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-9检测。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100 ul的分光光度检测杯检测,可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-9检测。
试剂盒组成:
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产品编号
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产品名称
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20T
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50T
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100T
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组份 A
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裂解液
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5ml
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10ml
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20ml
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组份 B
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Casepase-9底物
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200ul
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500ul
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1ml
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组份 C
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检测缓冲液
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5ml
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10ml
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20ml
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组份 D
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DTT
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100ul
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150ul
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250ul
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说明书
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1
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1
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1
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各组份储存条件:
裂解液、检测液2-8℃保存:
Caspase—9底物短期4℃避光保存,长期-20℃避光保。
DTT :-20℃保存
【注】:
l 长期不用可以-20℃保存。
l Caspase 底物在冬季气温较低时在室温时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
l 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
储存条件:
2-8°C避光保存
【注】
l 开盖后组份按要求条件保存。
l 拆封后请尽快使用完!
有效期:一年
检测方法:
酶标仪
分光光度计
样本类型:
●细胞
●组织
试剂盒以外自备试剂和仪器:
仪器准备:
l 酶标仪/分光光度计
l 离心机
l 移液器
l 冰箱
l 冰盒
试剂准备:
l PBS 缓冲液
(pH7.4,实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液phosphate buffersaline/Dulbecco’s PBS:约含8mM NaHPO,、2mM KH.PO,、137mM NaCl和13mM KCl)
l 或者HBSS (Hank's Balanced Salt Solution: With: Calcium Magnesium Glucose;Without: Phenol Red.Components:CaCl(anhydrous)140mg/L(1.261mM) 、MgCl-6HO100mg/L(0.493mM)、MgSO.-7HO 100mg/L.(0.407mM)、KCl 400mg/L (5.333mM)、KHPO。60mg/L(0.441mM)、NaHCO。350mg/L(4.167mM)、NaCl 8000mg/L(137.931mM)、NaHPO,(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM))
耗材准备:
l 离心管
l 吸头
使用方法:
使用注意事项;
l 须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过 100ul 的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405。
l 37℃下反应如果颜色变化不明显,可以适当延长反应时间。
l 如果样品中蛋白含量低,加大样品量,裂解样品时需设法使样品中的蛋白量达到200-500ug每样。
l 如果样品中激活的caspase水平很低,适当调节诱导细胞凋亡的时间,找一个caspase激活比较强的时间点进行检测。
l Caspase-3底物避光保存,使用过程中尽量避光。
l 底物为DMSO溶液,冬季气温较低时在室温时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解,吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
l 使用前,先将本品取出回温至室温,并对其进行简短离心使 DMSO溶液集中于管底。
一、裂解缓冲液和检测缓冲液配制
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液,每 1ml缓冲液中加入10ul DTT。充分混匀置冰上备用。
二、样品处理
A.细胞样品
1、收集2-5×10°个细胞,在4℃,500×g条件下离心2-3分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。
2、用冷PBS洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
3、在细胞中加入50ul冷的裂解缓冲液,高速涡旋振荡15秒。
4、置冰上持续振荡15-30分钟。
【注】
l 不同细胞样本需要的时间不一样,如果后续离心有较多沉淀,延长裂解时间,至无明显细胞沉淀为止。
5、在4℃,10000×g 条件下离心15分钟。
6、将上清吸入另一预冷的干净离心管,置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
B.组织样品
1、取适量组织样本剪碎,按照、50mg/100ul 冷的裂解缓冲液,用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体(或用液氮研磨),冰上振荡15-30分钟,小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
2、在4℃,12000×g 条件下离心5分钟。
3、快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
三、对上述处理过的上清进行蛋白定量。
【注】
l 必须进行蛋白定量,以保证后续步骤的蛋白上样量足够,否则容易出现检测不到结果的情况。
l 用BCA蛋白定量试剂盒进行定量的话,裂解液中不要加入DTT。
四、Caspase 8活性检测
1、 取50ul大约含100-200ug 蛋白的裂解上清,加入4Oul检测缓冲液。
2、 再加入10ul caspase-9底物,充分混匀。在37℃下避光反应1-4小时,有黄
色颜色产生即可进行检测,如果颜色变化不明显,时间可以延长,甚至孵育过夜。部分样品中激活的caspase-8水平较低,颜色变化不明显,直接上机检测,与对照组样品产品变化即可。
3、 测定A405nm 或A400nm。
4、 根据凋亡诱导的细胞的吸光值与空白对照细胞的吸光值的比值计算相对的Caspase 9活性程度。
注意事项:
l 正式实验前请选取几个样本做预实验,以优化实验条件,取得最佳实验效果。
l 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖和管内壁上的液体离心至管底,避免开盖时试剂损失。
l 禁止与其他品牌的试剂混用,否则会影响使用效果。
l 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
l 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿,可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
l 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
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