线粒体膜电位检测试剂盒
(JC-1法)
产品简介:
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)是利用JC-1探针检测线粒体膜电位变化的试剂盒,可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化,可以用于早期的细胞凋亡检测。
本试剂盒染料JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。与其他的阳离子染料如DiOC6(3)和罗丹明123相比,特异性更高,对线粒体膜电位变化的特异性高于质膜电位变化,对线粒体去极化检测的检测一致性更好;红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位的变化,不受线粒体大小,形状,密度的差异干扰;检测灵敏度强,对细胞应激反应的微小异质性都能辨别。
JC-1有单体和聚合体两种形式,两者的发射光谱不同。JC-1单体(J-monomer)的最大激发波长为514nm,最大发射波长为529nm;JC-1聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm,最大发射波长为590nm。
JC-1可以透过细胞质膜进入细胞,以单体状态游离于胞质内,正常健康细胞的线粒体的膜电位较高,具有极性,JC-1 依赖于膜电位的极性被迅速摄入线粒体的基质内,并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体,多聚体488nm激发时的最大发射波长为590nm,发射光为橙红色荧光,在流式图上表现为FL1和FL2双阳性;当细胞发生凋亡时,线粒体跨膜电位被去极化,线粒体膜电位较低,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,从线粒体内释放到细胞质,此时JC-1为单体,488nm激发时最大发射波长为527nm,可以产生绿色荧光,形成流式图中细胞FL1为阳性。凋亡细胞则大多为FL1单阳性。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降,同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
试剂盒组成:
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产品编号
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产品名称
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20T
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50T
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100T
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组份 A
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JC-1染色液
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100μL
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250μL
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500μL
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组份 B
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10X孵育缓冲液
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4ml
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10ml
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20ml
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说明书
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1
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1
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1
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各组份储存条件:
JC-1染色液-20℃避光保存,避免反复冻融。10×孵育缓冲液2-8°C保存。
【注】
l JC-1染色液需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。
l 染色液A为DMSO溶液,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
l 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热,否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
储存条件:
-20°C避光保存
【注】
l 开盖后组份按要求条件保存。
l 拆封后请尽快使用完!
有效期:一年
检测方法:
流式细胞仪
荧光显微镜
激光共聚焦
样本类型:
●悬浮细胞●贴壁细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器:
仪器准备:
l 流式细胞仪
l 离心机
l 移液器
l 冰箱
l 冰盒
试剂准备:
l PBS缓冲液( pH7.4,实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液(1X))( phosphate buffer saline/Dulbecco's PBS:约含8mM NazHPO:、2mMKHPO4、137mM NaCI和3mM KCI)
l HBSS(Hank's Balanced Salt Solution: With:Calcium MagnesiumGlucose: Without: Phenol Red。Components:CaClz(anhydrous)140mg/L(1.261mM)、MgClz-6HzO 100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7HzO100mg/L(0.407mM)、KCI 400mglL (5.333mM)、KH,PO460mglL(0.441mM)、NaHCO,350mg/L(4.167mM)、NaCl
8000mg/L(137.931mM)、NagHPOa(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM))
耗材准备:
l 离心管
l 吸头
l 一次性手套
使用方法:
使用注意事项;
l 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至管底,避免开盖时液体洒落。
l JC-1在温度较低时会凝固,可以20~25℃水浴温育片刻全部融解后离心使用。
l 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
l 配制染色工作液时,JC-1容易形成聚集体,所以需要边振荡边加。若仍有不溶的颗粒,可在,13000×g离心1分钟,吸取离心后的上清使用。
l 始终保持平衡染液中 pH值的一致性,因为pH值的变化将影响膜电位。
l 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白,他们将与部分染料结合,降低染料的浓度,引起假去极化。
l 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
l JC-1液产生沉淀离心取上清使用即可,不影响结果。
l JC-1染色并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。
l 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响,因诱导剂、细胞株类型,作用时间的不同而荧光强度比例都有不同,因此没有通用标准的补偿设门指南,因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。
JC-1染色工作液的配制:
根据样品数按下列比例配制JC-1染色工作液。实际试剂用量等比例调整。
1、 取5ul JC-1母液加入到450ul纯水中,剧烈振荡充分溶解并混匀。
2、 然后加入50ul孵育缓冲液(10×),混匀。
3、 即配成JC-1染色工作液。
【注】
l 必须先把JC-1用超纯水充分溶解混匀后,才可以加入.JC-1孵育缓冲液(10X)。不可先配制JC-1孵育缓冲液(1X)再加入JC-1母液,这样JC-1会较难充分溶解,可能会影响后续的染色检测。
悬浮细胞
1、 收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。细胞数量在2-5X10°个。
2、 用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。
3、 用500ul JC-1染色工作液将细胞重悬,37℃℃,5%CO2的培养箱中孵育15-30 分钟。
4、 在4°℃,300-500×g力离心间5分钟,弃培养基,收集细胞。
【注】
l 离心转速根据平时该细胞实验时的转速即可。
l 注意尽量不要吸掉细胞。
5、用冷PBS洗涤细胞两次。
【注】
l 300×g -500xg,2-8°c,离心时间5分钟收集细胞。
l 离心转速根据平时该细胞实验时的转速即可。
6、用500ul PBS将细胞重悬。
7、用流式细胞仪或荧光分光光度计检测分析结果,或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。
贴壁细胞
对于贴壁细胞,可以先收集细胞,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
【注】
l 如果是用共聚焦显微镜观察,也可以原位染色。
l 参照悬浮细胞的染色条件。
纯化线粒体
1、 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1孵育缓冲液(1×)稀释5倍。
2、 0.9mL5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1mL总蛋白量为10~100ug 的纯化的线粒体。
3、 结果检测
组织样本
组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。
结果分析:
检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm,发射光设置为530nm;
检测JC-1聚合物时,可以把激发光设置为525nm或568nm或者586nm,发射光设置为590nm。
用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况,绿色荧光通过FL1通道检测;红色荧光通过FL2通道检测。FL-1+,FL-2+为正常细胞,FL-1+,FL-2—为凋亡细胞。
用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察:
检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置,如观察GFP或FITC时的设置;检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光,如PI或Cy3时的设置。
出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降,并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常,细胞的状态也比较正常,线粒体膜电位降低,荧光强度减弱。
用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测:
激发波长为485nm,发射波长为590nm.如果使用荧光酶标仪,激发波长不能设置为485nm时,可以在475~一520nm范围内设置激发波长。
注意事项:
l 正式实验前请选取几个样本做预实验,以优化实验条件,取得最佳实验效果。
l 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖和管内壁上的液体离心至管底,避免开盖时试剂损失。
l 禁止与其他品牌的试剂混用,否则会影响使用效果。
l 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
l 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿,可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
l 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
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